Princip sublimace
Sublimace je čistící metoda, která využívá schopnosti krystalických látek přecházet přímo ze skupenství pevného na skupenství plynné, aniž by tály. Při zpětné kondenzaci par vzniká velmi čistá krystalická látka, která se při sublimaci zbaví netěkavých složek (znečištěnin). Další výhodou sublimace je, že krystalizující látka je velmi suchá a neobsahuje ani hydrátovou vodu.
Princip sublimace vychází z toho, že tlak nasycené páry sublimující látky se vyrovná s tlakem atmosférickým při nižší teplotě, než je její teplota tání. Za určitých podmínek (teplota a tlak) může sublimovat většina látek. Podmínky sublimace je možné určit z fázového diagramu dané látky a polohy sublimační křivky. Příkladem látky sublimující za běžné laboratorní teploty a normálního tlaku je jód nebo pevný oxid uhličitý (suchý led).
Termodynamicky je skupenské teplo sublimace součtem skupenského tepla tání a vypařování. Vyjadřuje se jako teplo potřebné k převedení 1 kg (molu) látky na plynnou fázi (kJ/mol, kJ/kg). Pro vodu je skupenské teplo tání 334 kJ/kg a vypařování (při 100 °C) 2260 kJ/kg. Skupenské teplo sublimace ledu je tedy 2594 kJ/kg. K tomu je ovšem nutné přičíst ještě hodnoty tepelné kapacity ledu (1,88 kJ/kg K) a vody (4,18 kJ/kg K), které zohledňují i změnu teploty (např. při lyofilizaci změnu z -20 °C na 100 °C). Skutečná potřeba energie k sublimaci ledu tedy převyšuje 3000 kJ/kg.
Sublimace za normálního tlaku
Sublimace za atmosférického tlaku se provádí u látek, které jsou dostatečně těkavé. Pro sublimaci je možné využít běžné pomůcky, jako jsou dvě hodinová sklíčka, případně sklíčko a nálevku, mezi něž se vloží filtrační papír. Páry látky přepážkou procházejí, po krystalizaci však papír brání tomu, aby látka padala zpětně na sklíčko.
Pokud se látka za vyšší teploty nerozkládá, lze sublimaci za normálního tlaku urychlit zahříváním. Zahřívat se ovšem musí opatrně. Zpětnou krystalizaci par lze podpořit chlazením, například tak, že se jímací nádobka naplní studenou vodou nebo se připojí na vhodný chladič. Na chladné ploše se vyloučí krystaly látky.
Sublimace za sníženého tlaku
Vakuová sublimace je rychlejší a šetrnější. Snížením tlaku nad sublimující látkou se rychleji dosáhne tlaku potřebného pro sublimaci; u velmi těkavých látek ale nelze tento postup využít.
Lyofilizace
Praktickým využitím vakuové sublimace je lyofilizace, neboli mrazové sušení. Při něm se odstraňuje z termolabilního materiálu voda za podmínek, kdy dochází k sublimaci ledu. Tento postup je velmi energeticky náročný, a proto se využívá u termolabilních látek citlivých na přítomnost vlhkosti, jako je např. biologický materiál (krevní plazma) nebo drahá léčiva (vakcíny, antibiotika, proteiny, hormony apod.).
Lyofilizátor je tvořen komorou, ve které probíhá sušení sublimací. V ní jsou umístěny kovové desky s vyhříváním, na které se klade sušený materiál ve vhodné nádobě, např. skleněné lahvičce (vialce). Komora je spojena s vývěvou a kondenzátorem ledu, kam je odváděna vznikající vodní pára.
Pomocné látky
Aby měl lyofilizát vhodné vlastnosti a nedošlo k poškození obsažených léčiv, přidávají se do přípravku specifické pomocné látky. Formulace takového přípravku je velmi složitá.
Protože obsah léčiva je malý, obvykle mezi 5-30 %, tvoří většinu přípravku plnivo, které doplňuje objem přípravku. Nejčastěji používanou látkou je mannitol. Ten současně umožňuje úpravu osmotického tlaku (izotonizaci) přípravku.
Kryoprotektivní látky chrání materiál před působením mrazu a vznikajících krystalů ledu. Většinou se přidávají různé pufry, jako je citronan sodný, octan sodný nebo fosforečnan sodný nebo draselný. Lyoprotektivní látky chrání materiál v usušeném stavu. Nejběžněji se používají polyhydroxysloučeniny, jako jsou mono- nebo disacharidy (sacharosa, maltosa, trehalosa nebo laktosa) nebo polyalkoholy (polyethylenglykol, glycerol). Velmi často se používají také aminokyseliny, např. glycin, alanin, lysin. Makromolekulární léčiva (hormony) se musí stabilizovat před denaturací a ztrátou aktivity. Proto se k nim přidává lidský albumin a tenzidy, např. polysorbát nebo poloxamer.
K zajištění mikrobiální stability vícedávkových přípravků se musí také použít protimikrobní látky, např. thiomersal.
Postup lyofilizace
Vlastní lyofilizace probíhá v několika etapách.
I. Mražení
V první etapě lyofilizace se materiál za atmosférického tlaku (101 kPa) musí zmrazit na teploty -15 až -50°C. Rychlost chlazení ovlivňuje velikost vznikajících krystalů. Při pomalém chlazení vzniká menší množství velkých krystalů. Velké krystaly lépe sublimují, ale z důvodu snížení rizika poškození vznikajícími krystalky ledu se především u biologických materiálů upřednostňuje rychlé chlazení, kdy se vytváří velké množství malých krystalků. Dalším důvodem je, že vypadáváním ledu z roztoku dochází k jeho postupnému koncentrování, což by mohlo rovněž vyvolat změny v materiálu.
Aby mražení a následné sušení probíhalo rovnoměrně a přiměřenou dobu, musí se materiál umístit do vhodné nádoby v tenké vrstvě. Vhodnou variantou je rotující nádobka, ve které se produkt namrazí na stěny.
Během mražení se za normálního atmosférického tlaku snižuje teplota materiálu. Po dosažení teploty tuhnutí vody se začínají tvořit krystalky ledu a koncentrace zbylého roztoku se postupně zvyšuje. Tento proces trvá až do dosažení tzv. eutonické teploty, což je nejnižší teplota, při které spolu za daného tlaku koexistuje tuhá a kapalná fáze. Dalším snížením teploty veškerý materiál zmrzne a vznikne pouze tuhá fáze.
Amorfní látky nevykazují eutonickou teplotu, ale tzv. kritický bod. Teplota se obvykle snižuje o cca 10-20 °C pod eutonickou teplotu nebo kritický bod, aby se zajistilo, že led bude přednostně sublimovat namísto tání.
II. Primární sušení
Po zmrazení veškerého materiálu se proces sublimace ledu zahájí postupným snižováním tlaku nad materiálem. Při dané teplotě se sušící komora evakuuje, až dojde k protnutí sublimační křivky na fázovém diagramu vody a led začne sublimovat. Obvykle se hodnota vakua pohybuje v oblasti několika desítek až jednotek pascalů. Aby vznikající páry nesnižovaly hodnotu vakua, musí být rychle odváděny od sušeného materiálu pryč do kondenzátoru ledu, kde ochlazením znovu krystalizují. Rozdíl v tlacích nad sušeným materiálem a v sušící komoře je hybnou silou celého sublimačního sušení.
Proces sublimace je energeticky náročný. Skupenská změna z tuhé fáze na plynnou, tj. sublimace, vyžaduje dodání skupenského tepla sublimace. Proto musí být hluboce zmražený materiál lokálně ohříván prostřednictvím kontaktu s vyhřívanou deskou, na které je umístěn. Množství dodaného tepla musí být takové, aby postačovalo ke správnému průběhu procesu sublimace, nesmí však způsobit tání materiálu a zhroucení jeho struktury.
Materiál se suší směrem ode dna nádoby, tj. od místa kontaktu s vyhřívanou deskou. Hranice mezi vysušeným a zmraženým materiálem se postupně posouvá směrem vzhůru, až dosáhne povrchu. Při primárním sušení ztratí materiál cca 95 % obsažené vody.
III. Sekundární sušení
Po vysušení se zahájí třetí fáze lyofilizace, během které se z materiálu odstraňuje zbytková vlhkost. Této etapě se říká sekundární sušení. Zatímco tlak v sušící komoře je stále velmi nízký, teplota se postupně zvyšuje nad 0 °C a dochází k tzv. vakuovému sušení. Podle povahy materiálu se teplota v komoře může zvýšit až na cca 40 °C. Na konci této etapy je zbytková (reziduální) vlhkost v materiálu několik procent, velice často ale i méně než 1%.
IV. Poslední fází lyofilizace je opatrné vyrovnání tlaku (zrušení vakua) vháněním suchého filtrovaného vzduchu nebo inertního plynu (např. dusíku nebo argonu) a uzavřením obalu. Při výrobě parenterálních přípravků musí tento proces probíhat za aseptických podmínek.
Vlastnosti lyofilizátu
Výhodou sublimace je šetrné a velmi účinné odstranění vlhkosti z termolabilních materiálů. Za podmínek lyofilizace nedochází u biologických materiálů ke změnám vyvolaným nežádoucími enzymatickými reakcemi ani k rozsáhlé mikrobiální kontaminaci.
Vysušený materiál (lyofilizát), obsahuje po usušení jen velmi malé množství vlhkosti. Pokud je obal hermeticky uzavřen, nemůže dojít k absorpci vzdušné vlhkosti a přípravek je stabilní po několik let i při uchovávání za laboratorní teploty.
Typické pro sušení lyofilizací je, že během sublimace se objem přípravku mění jen minimálně. Vzniklý produkt tak má objem srovnatelný s původním roztokem. Díky sublimaci velkého množství malých krystalků vzniká síťovitá struktura s velkým množstvím pórů, do které při zpětném rozpouštění (rekonstituci) roztoku proniká rozpouštědlo, obvykle voda, velmi snadno a rychle. Důsledkem je téměř okamžité rozpuštění lyofilizátu.
Procvičení
- Přečistěte 1,0 g jódu sublimací za atmosférického tlaku.
Kontrolní otázky
- Objasněte princip sublimace.
- Vysvětlete postup sublimace za normálního tlaku.
- Vysvětlete, co je lyofilizace.
- Co je skupenské teplo sublimace?
- Jaké pomocné látky se při lyofilizaci používají?
- V jakých etapách probíhá lyofilizace?
- Jak probíhá mražení při lyofilizaci?
- Jak probíhá primární sušení při lyofilizaci?
- Jak probíhá sekundární sušení při lyofilizaci?
- Uveďte výhody lyofilizace a charakteristiky lyofilizátu.